.png){kind=logo}
Xét nghiệm phân tử
- Cho tới thời điểm hiện tại, phương pháp xét nghiệm phân tử đang là tiêu chuẩn vàng chẩn đoán và sàng lọc COVID-19.
- Xét nghiệm phân tử có khả năng đáp ứng được các tác nhân gây bệnh mới xuất hiện như virus SARS-CoV-2, nhưng nó không phải là phương pháp mang nhiều ưu điểm trong ứng dụng sàng lọc do chi phí cao
- Thời gian thực hiện xét nghiệm lâu hơn so với các phương pháp huyết thanh học.
Nguyên tắc chung
- Phương pháp xét nghiệm phân tử là dựa vào trình tự gen đã biết, thiết kế một bộ mồi cho các vùng gen đặc trưng của tác nhân gây bệnh, sử dụng bộ mồi này để thực hiện phản ứng khuếch đại gen trong ống nghiệm bằng phản ứng PCR.
Tiến hành xét nghiệm
- Lấy mẫu bệnh phẩm: Gạc họng, dịch rửa phế quản…
- Tách chiết RNA tổng số từ mẫu.
- Thực hiện phản ứng phiên mã ngược từ RNA sang cDNA.
- Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen đặc trưng của virus.
- Phân tích kết quả.
Trình tự mồi và đầu dò trong phản ứng RT-PCR xác định nCoV
- Yếu tố quan trọng nhất trong xét nghiệm phân tử xác định virus 2019-nCoV là các cặp mồi và đầu dò dùng trong phản ứng RT-PCR, để đảm bảo nhận diện chính xác virus SARS-CoV-2.
- WHO đã tổng hợp các trình tự mồi cũng như trình tự đầu dò cho phản ứng RT-PCR xác định virus SARS-CoV-2 của một số phòng thí nghiệm trên thế giới, số liệu cũng chỉ rõ trình tự mồi đó nhận diện vùng gen nào của virus.
- Gene đích của một số trung tâm xét nghiệm SARS-CoV-2 trên thế giới
Cách lấy mẫu và tách chiết RNA
- Đối với gạc tăm bông nhúng vào ống chứa 1,5 ml DMEM và thêm FBS 2% vào mỗi ống.
- Dịch nổi được thu thập sau khi ly tâm ở tốc độ 2.500 vòng/phút. Trộn đều trong 60 giây và để yên trong 15 - 30 phút.
- Dịch nổi thu từ gạc hoặc dịch rửa phế quản (không xử lý trước) được thêm vào dung dịch đệm ly giải để chiết RNA hoặc cho vào môi trường vận chuyển virus để phân lập virus.
- Môi trường vận chuyển virus bao gồm dung dịch muối cân bằng Hank (pH 7.4) có chứa BSA (1%), amphotericin (15mlg/ml), penicillin G (100 đơn vị/ml) và streptomycin (50μg/ml).
Tìm gene đặc hiệu bằng PCR (Thực hiện phản ứng RT-PCR)
- Đầu tiên cần tách được RNA virus có trong mẫu, tách chiết RNA được gợi ý dùng các sản phẩm thương mại như QIAamp viral RNA mini kit của Qiagen hoặc High Pure Viral RNA Kit của hãng Roche.
- Bước tiếp theo là tổng hợp thư viện cDNA từ RNA toàn phần thu được sau tách chiết. Gợi ý có thể sử dụng kit Super Script IV Reverse Transcriptase của hãng Thermo với mồi random hoặc mồi oligod T cùng hãng Thermo.
- Ngoài ra, chúng ta có thể chạy Realtime RT-PCR một bước không cần qua tổng hợp cDNA khi sử dụng kit QuantiTect Probe RT-PCR của Qiagen trên máy LightCycler96 system của Roche.
Xét nghiệm huyết thanh học
- Phương pháp huyết thanh học là chẩn đoán được sử dụng để xác định kháng thể và kháng nguyên trong mẫu huyết thanh và huyết tương của bệnh nhân thông qua phản ứng đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể.
- Một số kỹ thuật huyết thanh học có thể được sử dụng tùy thuộc vào các kháng thể được nghiên cứu như ELISA, ngưng kết, kết tủa, kháng thể huỳnh quang hay hoá phát quang trên các hệ thống phân tích tự động.
- Kit Maglumi 2019-nCoV (SARS-CoV-2) IgM/IgG (Snibe Trung Quốc) hiện đang được các bệnh viện ở Trung Quốc sử dụng, với khả năng phát hiện nhanh và độ đặc hiệu cao, được cấp phép sử dụng trên lâm sàng.
- Kết quả của phương pháp đã được xác nhận trên một bệnh nhân vào ngày 23 tháng 12 năm 2019 (ICU-06).
Nguồn: Bệnh viện Đại học Y Hà Nội
